Grupos de Investigación
Sede San Martín

Laboratorio de Simbiosis rizobia-leguminosas

Una de las principales fuentes de nitrógeno biológicamente fijado en el sistema agrícola es a través de la simbiosis que ocurre entre rizobia (término que abarca a los géneros bacterianos: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium) y las leguminosas. Rizobia es capaz de colonizar en forma específica las raíces de las leguminosas e inducir en ellas órganos especializados, llamados nódulos, donde ocurre la fijación del N2. La formación del nódulo requiere una secuencia de eventos altamente regulados y coordinados que comienza con el intercambio de señales entre la planta hospedadora y la bacteria simbionte. Nuestro objetivo general es estudiar a nivel molecular la interacción de Mesorhizobium loti con las leguminosas analizando tanto el papel que tienen distintos componentes bacterianos así como la respuesta que se genera en la planta.

Integrantes

Director
Dra. Viviana Claudia Lepek

Ph.D., Profesora Adjunta UNSAM

Profesora a cargo de la materia Métodos de Análisis Biomédicos

Dictado de clases en Microbiología General

Evaluadora del curso de Seminarios

Miembros actuales

Lic. Andrés Zalguizuri: Lic. en Biotecnología, Tesista UNSAM

Ana Clara González: estudiante tesinista UADE

Dra Laura Ana Basile: Investigadora Asistente del Conicet.

Líneas de investigación

Componentes bacterianos relevantes para la eficiencia del proceso simbiótico y/o para la competitividad para la nodulación.

En el laboratorio hemos estudiado el rol en la interacción Mesorhizobium loti Ayac 1 BII (cepa autóctona)-Lotus spp, de genes involucrados en la síntesis de distintos componentes bacterianos: gen de la fosfoglucomutasa (pgm) y gen de la glucógeno sintasa (glgA) (1), gen de la glucano cíclico sintasa (cgs), y genes involucrados en la síntesis del lipopolisacárido (lpsβ1 y lpsβ2) (2, 4). Actualmente nos encontramos caracterizando los sistemas de secreción de proteínas en Mesorhizobium loti MAFF303099 y el papel que cumplen en la interacción tanto con Lotus spp., como con Leucaena leucocephala. Hemos comenzado con la caracterización del sistema de secreción de tipo III (T3SS). Mediante una búsqueda in silico de posibles efectores secretados por este sistema identificamos 3 posibles candidatos (6) y determinamos su participación en el proceso de nodulación (8). Actualmente estamos finalizando la caracterización del sistema de secreción TAT de M. loti MAFF303099 y de dos proteínas Rieske Fe/S secretadas por el mismo cuya funcionalidad está involucrada en el proceso simbiótico (manuscrito en preparación). También hemos adjudicado una función para una proteína codificada en el cluster de genes del T3SS cuya función no se conocía. La proteína Y4yS codificada por el gen mlr8765 participaría en la localización de la secretina del T3SS en membrana (10). Recientemente hemos determinado la existencia de una regulación inversa entre la expresión del factor transcripcional TtsI, que regula positivamente el sistema de secreción de tipo III, y la producción del flagelo (11).

Cambios a nivel transcripcional generados en raíces de Lotus japonicus durante el proceso de nodulación.

En el laboratorio hemos analizado el transcriptoma inducido en raíces de Lotus japonicus durante el proceso de nodulación que ocurre ante la inoculación con M. loti Ayac 1 BII cepa silvestre y comparado el mismo con aquel que se observa al inocular en cambio con una mutante afectada en la síntesis del glucano cíclico (mutante cgs) o con otra afectada en la síntesis del antígeno O del lipopolisacárido (mutante lpsβ2) (5). Se encontraron cientos de genes diferencialmente inducidos al comparar la inoculación con la cepa silvestre respecto a la inoculación con la mutante cgs. La inducción de estos genes dependería de la capacidad de la bacteria de invadir el nódulo (5). Muchos de estos genes a su vez mostraron un retardo en su inducción al inocular con la mutante lpsβ2 en concordancia con la mayor dificultad de esta cepa comparada con la silvestre en ocupar el nódulo (5). Entre los genes diferencialmente inducidos se encuentran varios relacionados con respuesta de defensa. Mediante el ensayo de RT-PCR en tiempo real se analizó la cinética de la expresión de algunos de estos genes. Los resultados obtenidos evidencian la existencia de un control de la respuesta de defensa de la planta por parte de la bacteria (5).

Predicción de proteínas secretadas por distintos sistemas de secreción bacterianos.

Se diseño una metodología novedosa para la predicción de efectores secretados por los sistemas de secreción de tipo III, IV y VI de bacterias basado en la dependencia evolutiva que mantienen los distintos efectores con el sistema por el cual se secretan. Este método no depende de la presencia de secuencias señal específicas (manuscrito en preparación).

Investigación aplicada

Efecto de la expresión constitutiva de la enzima ACC deaminasa en el proceso de nodulación y micorrización.

La simbiosis entre leguminosas y rizobia favorece el crecimiento de la planta en ausencia de fertilizantes nitrogenados. La fitohormona etileno, que se induce ante distintas condiciones de estrés, afecta negativamente esta asociación. En el laboratorio construímos cepas de M. loti que expresan en forma constitutiva la enzima ACC deaminasa, capaz de reducir la formación de etileno en su entorno, y evaluamos su efecto sobre la eficiencia de nodulación, la competitividad bacteriana para la nodulación así como sobre la nodulación en distintas condiciones de estrés (7).

Obtención de cepas de Bradyrhizobium japonicum resistentes a glifosato.

El glifosato es el herbicida comúnmente usado en los cultivos de soja transgénica. Bradyrhizobium japonicum (la bacteria que nodula la soja), al igual que las plantas, posee los genes que codifican para las enzimas utilizadas en el metabolismo del ácido shikímico, sustrato para la producción de compuestos aromáticos (flavonoides, aminoácidos aromáticos, etc). La actividad de una de estas enzimas, la 5-enolpiruvilshikimato-3 fosfato sintasa (EPSPS) es inhibida por el glifosato, por lo tanto la presencia de glifosato en el campo afecta el crecimiento de la bacteria y por ende el proceso de nodulación y el rendimiento de los cultivos de soja. Hemos obtenido, mediante mutagénesis puntual del sitio activo de la enzima, una cepa de B. japonicum tolerante al glifosato. Este trabajo fue seleccionado para ser expuesto en INNOVAR 2014 (9).

Publicaciones Científicas

  • Lepek, V. C., D'Antuono, A. L., Tomatis, P. E., Ugalde, J. E., Giambiagi, S., and Ugalde, R. A. “Analysis of Mesorhizobium loti Glycogen Operon: Effect of Phosphoglucomutase (pgm) and Glycogen Synthase (glgA) Null Mutants on Nodulation of Lotus tenuis”. Molecular Plan- Microbe Interactions, 15 (4):368-375 (2002).2. D'Antuono, A. L., Casabuono,
  • A., Couto, A., Ugalde, R. A., and Lepek, V. C. “Nodule development induced by Mesorhizobium loti mutant strains affected in polysaccharide synthesis”. Molecular Plant-Microbe Interactions, 18 (5):446-457 (2005).
  • Lepek, V. L. and D'Antuono, A. L. “Bacterial surface polysaccharides and their role in the rhizobia-legume association”. Lotus Newsletter, 35:93-105 (2005).
    Casabuono, A.C., D'Antuono, A., Sato, Y., Nonami, H., Ugalde, R., Lepek, V., Erra-Balsells, R., and Couto, A.S. “A matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry approach to the lipid A from Mesorhizobium loti”. Rapid Commun. In Mass Spectrom. 20:2175-2182 (2006).
  • D'Antuono, A. L., Ott, T., Krusell, L., Voroshilova, V., Ugalde, R. A., Udvardi, M., and Lepek, V. “Defects in rhizobial cyclic glucan and lipopolysaccharide síntesis alter legume gene expresión during nodule development”. Molecular Plant-Microbe Interactions, 21(1):50-60 (2008).
  • Sanchez, C., Iannino, F., Deakin, W., Ugalde, R. A., and Lepek, V. C. “Characterization of the Mesorhizaobium loti MAFF303099 type three protein secretion system”. Molecular Plant-Microbe Interactions, 22:519:528 (2009).
  • Conforte, V., Echeverría, M., Sanchez, C., Ugalde, R., Menéndez, A., y Lepek, V.C. “Engineered ACC deaminase-expressing free-living cells of Mesorhizobium loti shows increased nodulation efficiency and competitiveness on Lotus spp.” J. Gen. Appl. Microbiol. 56:331-338 (2010).
  • Sánchez C., Mercante V., Babuin M.F., and Lepek V.C. “Dual effect of Mesorhizobium loti T3SS functionality on the symbiotic process”. FEMS Microbiol. Lett. 330:148-156 (2012).
  • Lepek V.C., y Quelas J.I. Catálogo de la décima edición del concurso nacional de innovaciones INNOVAR 2014
  • Mercante, V., Duarte, C.M., Sánchez, C.M., Zalguizuri, A., Caetano-Anollés, G. and Lepek, V.C. “The absence of protein Y4yS affects negatively the abundance of T3SS Mesorhizobium loti secretin, RhcC2, in bacterial membranes”. Frontiers in Plant Science 6: 1-12 (2015).
  • Duarte C.,M., Basile A.L., Zalguizuri A., and Lepek V.C. “The transcriptional factor TtsI is involved in a negative regulation of swimming motility in Mesorhizobium loti MAFF303099”. FEMS Microbiol. Lett. 363:doi:10.1093/femsle. fnw222 (2016).

Colaboraciones

  • FCEyN-UBA: Dra Alicia Couto: Análisis de la composición del lipopolisacárido de Mesorhizobium loti.
  • FCEyN-UBA/INTECh: Dra Ana Menendez: efecto de la expresión constitutiva de ACC deaminasa en la nodulación.
  • Max-Planck/ Golm, Alemania: Dr. Thomas Ott y Dr. Michael Udvardi. Análisis del transcriptoma de raíces de Lotus japonicus ante la inoculación con distintas cepas de Mesorhizobium loti.
  • Universidad de Geneve, Suiza: Dr. William Deakin. Caracterización del sistema de secreción de tipo III (T3SS) de Mesorhizobium loti y su rol en la nodulación de Lotus spp. y Leucaena leucocephala. Universidad de Illinois, EEUU: Dr. Gustavo Caetano-Anollés. Uso de herramientas bio-informáticas para la identificación de proteinas de candidatas para ser secretadas por los diversos sistemas de secreción de M. loti.
  • Universidad de La Plata. Dr. Juan Ignacio Quelas. Tolerancia de B. japonicum a glifosato.

Participación en proyectos de investigación financiados

  • Subsidio para la Colaboración Cientifico-Académica entre grupos locales y grupos alemanes (Programa realizado en asociación con el DAAD). Otorgado en Abril del 2003 por la Fundación Antorchas. Titulares: Dr. Rodolfo Ugalde (Argentina) y Dr. Michael Udvardi (Alemania). “Molecular interactions between Lotus japonicus and Mesorhizobium loti wild-type and mutant strains”. Duración 2 años.
  • PICT 2004 de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Titular: Dr. Rodolfo Ugalde. “Mecanismos moleculares que controlan la vida intracelular de las alfa proteobacteria: los casos de Brucella abortus y Mesorhizobium loti”. Duración 3 años. Integrante del grupo responsable.
  • Programa de Subsidios para Proyectos de Investigación, Desarrollo y Transferencia (CIC), 2005. Titular: Dra Ana Menendez. “Evaluación a campos de cepas de Glomus intraradices y Mesorrhizobium loti que incrementan la tolerancia a sal de Lotus glaber y análisis de la ACC deaminasa como criterio de eficiencia en la interacción simbiótica.
  • Subsidio UNSAM otorgado en el 2006 para la realización del trabajo: Titular: Dra Viviana Lepek. “Análisis de la relevancia de distintos componentes de Mesorhizobium loti en la determinación de su competitividad en la nodulación”. Duración 2 años.
  • PICT 2007 de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Titular: Dra Viviana Lepek. “Simbiosis rhizobia-leguminosa: efecto de distintos componentes bacterianos sobre la respuesta de defensa de la planta”. Duración 3 años.
  • PICT 2011 (Raíces) de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Titular: Dra Viviana Lepek. Co-integrante del grupo responsable: Dr. Gustavo Caetano-Anollés. “Integración del uso de herramientas bio-informáticas y análisis experimental para la identificación de proteínas secretadas por Mesorhizobium loti. Implicancia en el proceso simbiótico”.
  • Proyecto Puente UNSAM 2013.
  • Proyecto Puente UNSAM 2014.
  • PICT joven 2017. de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Titular: Dra Laura Ana Basile. “Caracterización de los sistemas de secreción TAT y tipo II de Mesorhizobium loti en relación al proceso simbiótico con Lotus sp.”