Grupos de Investigación
Sede San Martín

Laboratorio de Parasitología Molecular

Los tripanosomátidos son protozoos flagelados que pertenecen al orden Kinetoplastida. Estos organismos revisten importancia sanitaria y económica debido a que son agentes etiológicos de diversas enfermedades que afectan al hombre y animales domésticos en todo el mundo. Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas en América Latina, T. brucei provoca la enfermedad del sueño en África, mientras que Leishmania sp. es el agente etiológico de la leishmaniasis en todo los continentes, salvo Oceanía. Nuestro laboratorio estudia los mecanismos moleculares involucrados en la regulación postranscripcional de la expresión genética en parásitos protoozoarios, al mismo tiempo que caracteriza posibles blancos de ataque para el desarrollo de agentes quimioterápicos y vacunas en la enfermedad de Chagas.

Integrantes

Director
Dr. Alberto Carlos C. Frasch
Investigador Superior CONICET
Decano del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
Profesor Titular DE (UNSAM)
Foreign Associate of the National Academy of Sciences
USA Scholar Howard Hughes Medical Institute
Miembros actuales

Dr. Alejandro Cassola, Investigador Asistente CONICET

Dra. Vanina Campo, Investigador Adjunto CONICET

Líneas de investigación

Estudio de interacciones RNA-proteína en el parásito Trypanosoma cruzi.

Los parásitos protozoos son células eucarióticas únicas que deben regular rápidamente la expresión de sus proteínas para adaptarse eficientemente a los distintos ambientes donde habitan. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los organismos eucariotas, ellos no controlan la expresión de sus genes a nivel del inicio de la transcripción, sino mediante mecanismos post transcripcionales. En nuestro laboratorio se estudian los factores y eventos moleculares que intervienen en este tipo de control. Hace unos años, describimos una nueva superfamilia de proteínas con dominios de unión a ARN del tipo RRM (RNA-recognition motif). Las tres especies mencionadas poseen un conjunto similar de proteínas ortólogas, sugiriendo la utilización de procesos postranscripcionales comunes. Las proteínas RRM habrían coevolucionado con sus ARNm blancos en los diferentes linajes evolutivos debido a que hay muy pocas proteínas de este tipo universalmente conservadas. Se caracterizaron complejos ribonucleoprotéicos que contienen proteínas RRM y se demostró que algunas proteínas son moduladas in vivo para favorecer, o no, la interacción con transcriptos específicos de manera regulada durante el desarrollo de T. cruzi. En particular, TcUBP1 y TcRBP3 unen ARNm blancos funcionalmente relacionados; los cuales contienen elementos estructurales de tipo tallo-bucle en sus regiones 3’-UTR que son determinantes para que ocurra dicha interacción.

Procesamiento y maduración de pre-ARN mensajeros dicistrónicos.

La transcripción es policistrónica y los transcriptos son procesados por trans-splicing y poliadenilación.co-transcripcionalmente. En el laboratorio se identificó y caracterizó un precursor de ARNm estable dicistronico, TcUBP, el cual sufre un segundo paso de trans-splicing y poliadenilación que origina los ARNm monocistrónicos maduros. Los motivos encontrados en cis en la región ICR de TcUBP podrían estar relacionados con la regulación del proceso de trans-splicing debido a que la proteína DRBD4, homóloga de la proteína PTB de mamíferos, interacciona con este transcripto. Los transcriptos de la enzima trans-sialidasa poseen sitios de trans-splicing y poliadenilación que también son enmascarados durante el procesamiento cotranscripcional de los policistrones, generando un precursor que es procesado por estas mismas reacciones en un paso posterior. Esta omisión en el procesamiento de algunos sitios de splicing podría ser parte de un nuevo mecanismo postranscripcional de regulación de la expresión genética en tripanosomas, donde moléculas precursoras de ARNm son sometidas a un proceso de maduración mediado por un segundo evento regulado de trans-splicing

Formación de gránulos ribonucleoprotéicos durante estrés nutricional.

El metabolismo del ARNm en estos parásitos también involucra el reclutamiento de transcriptos y proteínas en estructuras citoplasmáticas microscópicamente visibles denominadas gránulos ribonucleoprotéicos. Dichas estructuras contienen proteínas ortólogas a las presentes en los gránulos de estrés y P bodies de organismos multicelulares, junto con transcriptos celulares que están siendo traducidos, por lo que se sugiere que su función es proteger al ARNm de su degradación. La formación de los gránulos de ARN se observa luego de someter a los parásitos a condiciones de estrés nutricional (en cultivos axenicos), como así también en los tripanosomas presentes en el tracto intestinal del insecto vector. Lo anterior indica que los tripanosomátidos hacen uso de la formación de gránulos de ARN para la protección transitoria de transcriptos como una estrategia de supervivencia en periodos de hambreado que deben superar durante sus complejos ciclos de vida.

Identificación de inhibidores de la actividad de trans-sialidasa y su efecto en infecciones por Trypanosoma cruzi.

Las trans-sialidasas (TS) son enzimas propias de algunos tripanosomas utilizadas para obtener ácido siálico de los glicoconjugados presentes en circulación y en los tejidos del huésped y sialidar moléculas de mucinas aceptoras en la superficie del parásito. Las TS son sialidasas modificadas, mas eficientes en transferir ácido siálico hacia carbohidratos aceptores adecuados, que en hidrolizarlos. La comparación entre las estructuras tridimensionales de las TS de T. cruzi y T. rangeli, un tripanosoma relacionado, reveló varios aminoácidos que podrían ser críticos para la actividad de la TS, resultados que fueron confirmados por análisis de las mutantes. Hasta ahora no se conocen inhibidores químicos eficaces de la actividad TS, pues los utilizados para inhibir sialidasas no ejercen el mismo efecto en las trans-sialidasas. Dado que la TS cumple un papel fundamental en el ciclo de vida de este parásito y es, exclusiva de tripanosomas, es un blanco ideal para el desarrollo de nuevas quimioterapias o inmunoterapias contra los tripanosomas. A su vez, la estructura tridimensional provee un marco útil para diseñar inhibidores de la enzima. Los objetivos planteados en este proyecto son: a) identificar compuestos químicos que puedan constituir la base para el diseño racional de inhibidores de la actividad TS de T. cruzi; b) obtener anticuerpos neutralizantes de la actividad de TS de T. cruzi, en particular, producidos en llamas dadas sus ventajas biotecnológicas; y c) probar los anticuerpos y compuestos químicos que inhiban la actividad de TS en sistemas biológicos de infección por T. cruzi.

Ayuno T. brucei. Tripomastigotes procíclicos de T. brucei en ayuno de fuente de carbono por 3 horas. Canal rojo: gránulos de ARNm visualizados por hibridización fluorescente in situ de ARNm. Canal verde: TbPABP1 por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico colocalizando con gránulos de ARNm. Canal azul: ADN (nuclear y mitocondrial) teñido con DAPI. Estas estructuras citoplasmáticas protegen a los transcriptos de la degradación en condiciones de ayuno, para poder volver a utilizarlos como mediadores de la información genética en condiciones favorables.
Ayuno T. cruzi. Epimastigotes de T. cruzi en ayuno de fuente de carbono por 24 horas. Esta fotografía es la superposición de imágenes de campo claro, canal rojo y canal azul. En el canal rojo se muestran gránulos de ARNm utilizando hibridización fluorescente in situ de ARNm. En el canal azul se muestra el ADN (nuclear y mitocondrial) teñido con DAPI. Estos gránulos protegen los transcriptos de la degradación en condiciones de ayuno, y el ARNm almacenado en los gránulos puede volver a traducirse superado el stress nutricional.

Publicaciones

  1. The crystal structure and mode of action of trans-sialidase, a key enzyme in Trypanosoma cruzi pathogenesis. A. Buschiazzo, M.F. Amaya, M.L. Cremona, A.C. Frasch and P.M. Alzari. Mol. Cell 10: 757-768 (2002).
  2. TcUBP-1, an mRNA destabilizing factor from trypanosomes, homodimerizes and interacts with a novel AU-rich element- and poly(A)-binding proteins forming a ribonucleoprotein complex. I. D´Orso and A.C. Frasch. J. Biol. Chem. 277: 50520-50528 (2002).
  3. RNA Recognition Motif-type RNA-binding proteins in Trypanosoma cruzi form a family involved in the interaction with specific transcripts in vivo. J. De Gaudenzi, I. D´Orso and A.C. Frasch. J. Biol. Chem. 278: 18884-18894 (2003).
  4. The surface coat of the mammalian-dwelling infective trypomastigote stage of Trypanosoma cruzi is formed by highly diverse immunogenic mucins. Buscaglia, CA, Campo, V.A., Di Noia, J.M., Torrecilhas, A.C.T., De Marchi, C.R., Ferguson, M.A.J., Frasch, A.C. and Almeida, I.C. J. Biol. Chem. 279: 15860-9 (2004).
  5. Lactose derivatives are inhibitors of Trypanosoma cruzi trans-sialidase activity towards conventional substrates in vitro and in vivo. Agusti, R., Paris, G., Ratier, L., Frasch, A.C. and De Lederkremer, R.M. Glycobiology 14, 659-670 (2004).
  6. A Sialidase Mutant Displaying trans-Sialidase Activity. Gastón Paris, Laura Ratier, María Fernanda Amaya, Tong Nguyen, Pedro M. Alzari and Alberto Carlos Frasch. J. Mol. Biol. 345: 923-34 (2005).
  7. The genome of the kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science, 309:436-42 (2005).
  8. The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. El-Sayed NM, et al. Science, 309:409-15 (2005).
  9. RNA-Binding Domain Proteins in Kinetoplastids: a Comparative Analysis. De Gaudenzi J, Frasch AC, Clayton C. Eukaryot Cell. 4:2106-14 (2005).
  10. Trypanosoma cruzi mucins: changing the coat diversity depending on the host. C.A. Buscaglia, V. Campo, A.C. Frasch and J.M. Di Noia. Nat. Rev. Microbiol. 4: 229-236 (2006).
  11. Procyclic trypanosoma brucei expresses separate sialidase and trans-sialidase enzymes on its surface membrane. Montagna GN, Donelson JE, Frasch AC. J Biol Chem.  281(45):33949-58. (2006 Nov. 10)
  12. mRNA maturation by two-step trans-splicing/polyadenylation processing in trypanosomes. Jäger AV, De Gaudenzi JG, Cassola A, D'Orso I, Frasch AC. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 13;104(7):2035-42.
  13. Recruitment of mRNAs to cytoplasmic ribonucleoprotein granules in trypanosomes. Cassola A, De Gaudenzi JG, Frasch AC. Mol Microbiol. 2007 Aug;65(3):655-70.
  14. Functionally related transcripts have common RNA motifs for specific RNA-binding proteins in trypanosomes. Noe G, De Gaudenzi JG, Frasch AC. BMC Mol Biol. 2008 Dec 8;9(1):107.
  15. Relevance of the diversity among members of the Trypanosoma cruzi trans-sialidase family analyzed with camelids single-domain antibodies. Ratier L, Urrutia M, Paris G, Zarebski L, Frasch AC, Goldbaum FA. PLoS One. 2008;3(10):e3524.
  16. An RNA-recognition motif mediates nucleocytoplasmic transport of a trypanosome RNA-binding protein. Cassola, A., and Frasch, A.C. 2009. J. Biol. Chem. 284:35015-35028.
  17. RNA Recognition Motifs Involved in Nuclear Import of RNA-Binding Proteins. Cassola, A., Noé, G., and Frasch, A. C. 2010. RNA Biol. In press.

Colaboraciones

  • IIB-INTECH, Dr. Fernán Agüero.
  • IIB-INTECH, Dr. Juan J. Cazzulo y Dra. Vanina Alvarez.
  • Universidad de Georgia, Athens, USA, Dr. Roberto Docampo

Subsidios

  • ANPCyT, La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi: estructura y función. 2009-2010
  • HHMI, Post-transcriptional regulation of gene expression in trypanosomes. 2007-2011
  • PICT 2004, Estudios estructurales y funcionales de la trans-sialidasa de tripanosomas africanos y americanos.